Uitgewerkte examenvragen Biotechnologie - prof Deforce farmacie uGent

Elk jaar worden vragen uit vroegere jaren gesteld op het examen. Dit is een document met de uitgewerkte vragen (deze die niet uitgewerkt zijn, zijn van een vorige prof of werden al uitgewerkt).

Preview document (3 van de 40 pagina's)

Examen Januari 2018 1) Humaan tpa aanmaken , uit welke cellen zou je starten en leg de recombinatie uit en de
belangrijke dingen van expressievector.
Vertrekken van humane gen die codeert voor tPA.
mRNA isoleren uit humane cellen die tPA aanmaken (mRNA want alle intronen verwijderd =
kleiner). RNA gaan we isoleren van andere celbestanddelen door centrifugatie in
cesiumchloride oplossing (gaat gradiënt vormen tijdens centrifugeren). Ook homogeniseren
in een buffer die de Rnases zal onderdrukken.
Hierna krijgen we RNA dat bestaat uit de 3 soorten, maar we zijn alleen geinteresseerd in
mRNA. We kunnen dit opzuiveren door gebruik te maken van de polyAstaart aan het 3’
uiteinde. We gaan het RNA laten hybridiseren aan synthetitische streng van thymidines die
gehecht zitten aan onoplosbaar hars. De andere RNA soorten zullen de kolom gewoon
doorlopen terwijl mRNA zal weerhouden worden. Daarna buffer toevoegen die de
ionenconc op kolom wijzigt waardoor de AT waterstofbindingen te doorbreken.
mRNA omzetten naar cDNA via reverse transcriptase: wordt nromaal gebruikt door RNA
virussen om virale streng om te zetten in DNA. We maken gebruik van oligo dT primer die zal
hybridiseren met polyAstaart van mRNA. Reverse transcriptase zal nucleotiden toevoegen
die complementair zijn. Daarna zijn er 2 mogelijkheden:
op het einde van 3’ van 2e streng ontstaat een uiteinde die lusje zal vormen: we bekomen
compleet DNA
ofwel kan het zijn dat er vroegtijdig een lus ontstaat zodat het mRNA niet volledig werd
overgeschreven, hier zullen we incompleet DNA bekomen.
Daarna gaan we klenow fragment toevoegen (thermolabiel DNA polymerase) met 4
deoxyribonucleotides. We krijgen een onnatuurlijk stuk DNA dat dubbelstrengig is maar
bestaat uit 1 streng. We gaan het S1 nuclease gebruiken om door te knippen. Rnase H zal de
RNA streng verwijderen.
Uit cDNA via PCR gaan selecteren juiste gen (unit lengte producten door gebruik te maken
van specifieke primer)
We hebben op gen: signaalsequentie gevolgd door mature gen. (noodzakelijk dat cel
signaalsequentie zal herkennen en kunnen afknippen). Aan uiteinden: restrictieenzymes die
niet mogen knippen in het gen zelf.
Plasmide dat we gaan opkweken in bacteriën, isoleren en open knippen.
Op plasmide: promotor, ori voor bacterie, ampicilline resisitentiegen om bacterie te
selecteren die plasmide bevatten, terminator, dhfr, hat medium, tPA signaalsequentie en
tPA coderende gensequentie.
Plasmide bevat dezelfde restrictiesites: we gaan cDNA lygeren in plasmide. Daarna
plasmiden transformeren in bacteriën. We gaan bacteriën selecteren met plasmide via
AmpR gen en Controleren via PCR of het gewenste lengte is en met cycle sequencing of het
in juiste richting zit. Daarna introduceren in zoogdiercellen.
We willen dat zoogdiercel het ontvangen construct in haar eigen genoom integreert.
Zodanig dat wnr eigen genoom wordt gerepliceerd dat dochtercellen ook zelfde genetische
content hebben.
We gaan plasmide gaan lineariseren door open te knippen met restricitie enzymen. Deel van
de cellen zal het plasmide openknippen. Liposomen toevoegen  transformatie
Transformeren in zoogdiercel We gaan recombinant eiwit aanmaken door gebruik te mkane
van meiotische deling.
Daarna methode nodig om stabiele te selecteren.
Op dit moment gaat het over stabiele transformanten.
Er zijn opnieuw heel veel strategieën mogelijk. Dit is een voorbeeld. We kunnen dit door te
selecteren in hat medium = hypoxanthine aminopterrine en thymidine. We voegen die 3
stoffen toe om te gaan selecteren welke cellen het construct te hebben opgenomen. Om dat
systeem bruikbaar te maken gaan we cellen gebruiken die een mutatie hebben in minstens 1
van die 2 systemen. Ofwel in het thymidine kinase gen (tk-gen) ofwel in het hypoxanthine
fosforibosyltransferase gen (hort-gen). Cellen mogen ook mutatie hebben in beide.
Dat aminopterrine dat we toevoegen is een stof die ingrijpt in de biosynthese pathway van
de dNTPs die we nodig hebben om DNA-synthese te kunnen uitvoeren. Aminopterrine de
vorming van dATP en dGTP zal inhiberen. En ook omzetting van dUMP en dTMP gaan
inhiberen.
Hypoxanthine kan via hort-gen omgezet wordt in het IMP die dan weer kan omgezet worden
tot dATP en dGTP. We noemen dit een salvage pathway. We kunnen dus de inhibite van
aminopterrine gaan overbruggen.
Hetzelfde voor thymidine.
Alle normale cellen in ons lichaam hebben die twee enzymes. Dus die salvage pathway komt
voor in normale cellen. Dus als je aan normale cellen dat HAT-medium toevoegt dan gebeurt
er niets. Maar als cellen mutatie hebben in minstens in 1 van die twee enzymes dan heb je
geen overbrugging. Als we HAT-medium toevoegen zullen de cellen dus geen mutatie
kunnen uitvoeren en afsterven.
Aangezien zoogdiercellen vrij duur productiesysteem zijn en traag zijn willen we een hoog
rendement behalen. Daarvoor gaan we tweede selectiestap gaan uitvoeren. In dit geval door
toevoeging van methotrexaat. Methotrexaat zal het dihydrofalaat reductase gaan inhiberen.
Je normale folaat metabolisme cyclus verstoord en zal je cel in groei en metabolisatie
benadeeld worden.
Cellen brengen initieel lage niveaus van tPA tot expressie en na methotrexaatselectie een
hoog levels tot expressie. Dit is geen rechtstreekse selectie op het expressieniveau van dat
tPA. Doordat op ons genconstruct dat dihydrofolaat reductase gen aanwezig is, zullen cellen
die meer dat dihydrofolaat reductase aanmaken, hogere concentraties aan methotrexaat
kunnen verdragen dan cellen die lagere hoeveelheden dihydrofolaat reductase aanmaken.
We selecteren niet rechtstreeks naar het aanmaken van veel tPA, maar zullen we selecteren
naar cellen die veel dihydrofolaat reductase tot expressie brengen. We gaan ervan uit dat dit
gelinkt (linkage) is aan veel tPA tot expressie brengen omdat de genen qua genetische
afstand dicht bij elkaar zitten (namelijk op ons zelfde construct). Bij bacteriën en gistcellen is
dit veel minder relevant. Als we op die manier zoogdiercellen geselecteerd hebben die nu stabiel tPA tot expressie
brengen ook hoge expressie zullen hebben, dan gaan we typisch een klonale selectie
uitvoeren. In principe willen we verder werken met cellen die allemaal op dezelfde plaats in
hun genoom het construct hebben en dezelfde hoeveelheid keer het construct geïntegreerd
hebben in het genoom. En dus gaan we na vorige selectie individuele cellen gaan isoleren en
deze laten delen zodanig dat we klones krijgen. Ze zijn dus genetisch allemaal identiek aan
elkaar. Op die manier maak je een cellijn waarvan alle cellen het tPA op dezelfde plaats op
plaatsen in hun genoom geïntegreerd hebben. Als we dit soort cellen hebben, gaan we ze in
celcultuur brengen. Medium uit celcultuursysteem watn tPA si in medium gesecreteerd.
Opzuiveren dan
2) Wie heeft PCR reactie uitgevonden?
Kary Mullis 3) Wat is Tm en waar hangt dit vanaf?
Tm waarde of smelttemperatuur = temperatuur waarbij de helft van de basen in een duplex
ongepaard zijn. Tm waarde stijgt naarmate het GC gehalte ( aantal waterstofbruggen)
toeneemt en zout conc stijgt.
Zoutconc: 2 strengen zijn neg geladen. Als we kationen toevoegen dan gaan we de afstoting
verlagen zodat ze sneller gaan renatureren of hier beter bij elkaar blijven waardoor we een
hogere Tm waarde hebben.
Bepalen: bij 260 nm de absorptie meten. Je gaat cuvet gecontroleerd opwarmen. (Tk is 1).
Enkelstrengig DNA zal relatief veel meer licht absorberen dan dubbelstrengig. We gaan dit
uitzetten in grafiek (absorbantie bij 260 nm in functie van T)
Tm= waarde waarbij de helft enkelstrengig is. 4)
a) Welke aminozuren kunnen geglycolyseerd worden
asparagine, serine en threonine (gefosforyleerd: serine, threonine en tyrosine)
b) Welk belang heeft dit voor verschillende cellulaire organismen?
Gebeurt niet door eiwit zelf, maar door middel van spec enzymen. Komen niet voor in
bacteriën. Voor bepaalde humane eiwitten zijn glycosylaties niet noodzakelijk om functie uit
te oefenen. Zijn afhankelijk van omgevingsfactoren (T, medium, grootte vat, …). Als men
glycoproteïne zou toedienen dan kan dat immunogeniciteit reactie uitlokken.
5) Hoe voorkom je dat een plasmide sluit zonder insert?
We gaan zorgen dat plasmide moeilijker kan sluiten zonder insert. Dit door uiteinden geknipt
plasmide te gaan modificiëren. Normaal staat aan 5 een fosfaatgroep en aan 3 OH.
 We gaan ervoor zorgen dat geen fosfaatgroepen meer staan op 5, maar wel OH. Met
behulp van alkalische fosfatase. DNA ligase zal uiteinden niet meer aan elkaar kunnen
lygeren zonder insert (vorming van dna nicks) 6) Monoklonaal antilichaam aanmaken, hoe doe je dit ?

IMMUNISATIE
We gaan in eerste instantie polyklonale antisera aanmaken: zullen antilichamen bevatten
tegen allerlei antigenen. Serum die we dus uit muizen halen zijn polyklonale antisera. Om
deze proefdieren te gaan immuniseren, hebben we niet veel nodig van dat eiwit. Microgram
tot milligram van dat eiwit is voldoende en moet ook niet te zuiver zijn. B-cellen die we
straks uit proefdier zullen isoleren, zullen sowieso een grote poele zijn aan B-cellen die iets
anders maken dan antilichamen die we willen en dan toch nog zullen moeten deze
selecteren die het gewenste antilichaam aanmaken (want al B-cellen aanwezig
oorspronkelijk in bloed van muizen). We gaan die muizen herhaaldelijk immuniseren om zo
groot mogelijke kans te hebben op B-cel. (we gebruiken daarvoor adjuvantia met Freunds
complete en incomplete) We zullen typisch ons antigenpreparaat intradermaal of subcutaan